구매자 가이드 PCR 기술
중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 생의학, 임상 진단, 식품 미생물학 테스트 및 범죄 법의학을 포함한 다양한 분야에서 수많은 연구 및 테스트 실험실의 필수 요소입니다. 이 기본 기술은 열 순환을 사용하여 DNA 샘플이 빠르고 기하급수적으로 복제되어 수백만 또는 수십억 개의 시퀀스 사본을 생성하는 일련의 반응을 촉진합니다. 새로운 PCR 시스템을 구입할 때 애플리케이션의 최종 목표, 열 순환 장비의 정확성과 효율성, 기기의 용량과 유연성을 고려하는 것이 중요합니다. 이 문서에서는 PCR 시스템에 사용할 수 있는 다양한 옵션과 기능에 대한 개요를 제공하여 응용 분야에 적합한 시스템을 좁히는 데 도움을 줍니다.
1. PCR 대 정량 PCR 대 dPCR
모든 PCR 시스템은 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 DNA를 복제하지만 특정 결과를 얻기 위해 시스템마다 사용하는 방법이 다릅니다. 이러한 다양한 방법 중에는 표준 PCR, 정량적 PCR(정량 PCR) 및 디지털 PCR(dPCR)이 있습니다.
표준 PCR 기계는 일반적으로 추가 다운스트림 테스트 및 사용을 위해 DNA를 증폭하는 데 사용됩니다. 어떤 의미에서 이 기술은 분석 테스트 방법 자체가 아니라 최종 제품을 생성하는 수단으로 사용됩니다. 증폭된 DNA는 실시간이 아닌 PCR 반응이 완료된 후에야 측정이 가능하므로 이 방법을 끝-가리키다 PCR이라고도 합니다. 전통적인 PCR 증폭의 최종 생성물은 일반적으로 다운스트림 클로닝 및 시퀀싱에 사용되며, 겔 전기영동을 사용하여 표적 서열의 존재와 저해상도(밴드 강도 기준)에서의 상대적인 양을 확인하기 위해 확인할 수도 있습니다.
샘플에 존재하는 표적 서열의 양을 보다 빠르고 정확하게 정량화하기 위해 실시간 PCR로도 알려진 정량적 PCR(정량 PCR)은 증폭 과정에서 형광 프로브를 사용하여 각 열 주기 후에 존재하는 DNA의 양을 모니터링합니다. 형광 강도의 특정 임계값을 충족하는 데 필요한 주기를 관찰함으로써 분석가는 결과를 표준 곡선과 비교할 때 출발 물질의 DNA 양을 결정할 수 있습니다. qPCR은 또한 엔드포인트 PCR보다 표적 서열의 존재 여부를 더 빨리 확인할 수 있으므로 사스-코로나바이러스-2 검출과 같은 진단 응용 분야에 사용됩니다(역전사를 사용하여 바이러스 RNA를 cDNA로 먼저 전환).
디지털 PCR(dPCR)은 PCR 반응이 수천 개의 개별 반응 챔버에서 발생하는 또 다른 정량적 방법이며, 원래 샘플의 DNA 분자의 절대 수는 증폭이 완료된 후 얼마나 많은 반응 챔버가 형광 신호를 생성하는지에 따라 결정될 수 있습니다. . qPCR과 달리 형광 측정은 실시간으로 수행되지 않으며 샘플의 DNA를 정량화하기 위해 표준 곡선이 필요하지 않습니다. dPCR은 일반적으로 qPCR보다 처리량이 제한되고 비용이 높지만 DNA 정량화에서 더 정확하고 민감하며 정확하며 희귀 돌연변이 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 감지와 같은 응용 분야에 특히 유용합니다.
응용 분야를 고려할 때 종점(정성/반정량) PCR과 정량(정량 PCR 또는 dPCR) 방법을 선택할지 여부를 결정하는 것은 비교적 간단하지만 qPCR과 dPCR 중에서 선택하는 것은 더 미묘한 차이가 있을 수 있습니다. qPCR은 처리량이 많고 비용 효율적이며 많은 응용 분야에서 충분히 민감하지만 검출 한계가 낮은 절대 정량화가 가장 중요한 경우 dPCR이 더 나은 선택일 수 있습니다.
2. 온도 조절의 중요성
샘플의 온도를 정확하고 효율적으로 조정하고 제어하는 열 순환기의 능력은 증폭 반응의 성공을 가능하게 하는 것이며 모든 PCR 시스템 선택의 중심 초점이 되어야 합니다. 서로 다른 시스템은 램프 속도, 온도 균일성 및 정확도와 관련하여 서로 다른 기능을 제공할 수 있으며 PCR 방법 최적화를 지원하기 위해 열 블록 전체에서 온도 구배를 달성하는 기능을 제공할 수 있습니다.
램프 속도는 열 순환 단계 사이의 온도 변화 속도를 나타내며 일반적으로 기기 사양에서 초당 섭씨 온도(°C/초)로 표시됩니다. 제조업체는 최대 램프 속도 및 평균 램프 속도에 대한 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 기기의 램프 속도 증가(가열) 및 감소 속도(냉각)를 구별할 수 있습니다. 일반적으로 램프 속도가 높을수록 런타임이 빨라지지만 구매자는 기기 속도와 관련된 다른 지표를 검토하지 않고 최대 램프 속도에 초점을 맞추는 것에 주의해야 합니다. 계측기는 짧은 시간 동안만 최고 램프 속도에 도달할 수 있으며 평균 램프 속도는 온도 변화 속도를 더 잘 반영합니다. 램프 속도 사양은 특정 계측기가 얼마나 빨리 실행될 수 있는지에 대한 일반적인 아이디어를 제공할 수 있지만 가능한 경우
온도 정확도와 균일성은 성공적인 반응의 핵심이기도 합니다. 모든 열 순환기는 PCR에 필요한 온도를 생성하도록 설계되었지만 특정 기능은 더 높은 수준의 신뢰도를 제공할 수 있습니다. 임상 진단 및 법의학에서와 같이 가장 중요합니다. 고해상도 용융(HRM) 분석과 같은 민감한 기술을 위해 PCR 기계를 사용할 때 정밀한 온도 제어도 중요합니다. 가열된 뚜껑은 PCR 튜브 전체에서 더 나은 온도 균일성을 보장할 수 있습니다. 가열된 뚜껑이 없으면 시료가 온도가 더 낮은 튜브 상단으로 증발 및 응축될 수 있기 때문입니다. 열 블록 설계는 온도 제어에도 영향을 미칩니다. 알루미늄 블록은 가장 경제적인 옵션이지만 전도성이 가장 낮습니다. 즉, 더 많은 전도성 블록보다 더 천천히 온도 균일성을 달성하고 램프 속도가 더 낮습니다. 은과 금으로 코팅된 블록은 더 비싸지만 열 전달이 더 빨리 일어나도록 하여 블록 전체에 균일한 온도 분포를 보장합니다.
서로 다른 DNA 표적은 최상의 증폭 결과를 얻기 위해 서로 다른 온도를 요구할 수 있습니다. 예를 들어, GC가 풍부한 시퀀스는 변성을 위해 더 높은 온도가 필요합니다. 이상적인 어닐링 온도는 또한 다양한 요인의 영향을 받습니다. 반면 이 단계의 온도는 일반적으로 프라이머의 녹는 온도, 프라이머 쌍 사이의 녹는 온도 차이, 시약 농도, 산도 및 염 농도의 영향에 따라 선택됩니다. 반응 온도 조건 최적화를 복잡한 작업으로 만듭니다. 온도 구배 기능이 있는 PCR 기계는 단일 실행에서 여러 어닐링 온도를 테스트할 수 있도록 하여 PCR 방법의 최적화를 지원하도록 설계되었습니다. PCR 기계를 사용하여 분석하려는 샘플의 유형과 다양성에 따라
3. 열 블록
언급한 바와 같이 PCR 기기와 함께 사용되는 열 블록은 온도 제어에 차이를 만들 수 있지만 블록의 디자인과 다른 블록을 수용하는 기기의 디자인은 처리량, 소모품 비용 및 유연성에도 영향을 미칩니다. 일반적인 블록은 96웰 또는 384웰 형식으로 제공되지만 48웰 및 1536웰과 같은 다른 형식도 사용할 수 있습니다. 더 많은 웰 수는 더 적은 반응 부피로 더 높은 처리량을 가능하게 하며, 초기에는 비용이 더 많이 들지만 궁극적으로 각 웰에 사용되는 시약의 부피가 적어 반응당 가격이 낮아집니다. 얼마나 많은 샘플을 처리할 것인지와 기계를 얼마나 자주 사용할 것인지를 고려하면 웰 카운트가 적은 열 블록이 실험실에 가장 실용적이고 비용 효율적인지 여부가 결정됩니다.
일부 기기는 고정된 블록 형식으로 제공되는 반면 다른 기기는 상호 교환 가능한 블록을 사용할 수 있어 96웰과 384웰 형식 사이 또는 다양한 응용 분야에 대해 서로 다른 블록 재료 사이에서 전환할 수 있는 더 많은 유연성을 제공합니다. 일부 열 순환기는 또한 동일한 기기에 여러 블록을 수용하여 다양한 프로토콜을 동시에 다양한 샘플 세트에서 실행할 수 있습니다.3 "범용" 치수의 블록은 필요에 따라 다양한 크기의 튜브, 스트립 또는 PCR 플레이트를 사용할 수 있는 유연성을 더욱 향상시킵니다. .
온도 제어, 샘플 취급 및 처리량에서 이 구성 요소의 핵심 역할 때문에 열 순환기를 선택할 때 열 차단 옵션을 신중하게 고려해야 합니다. 샘플 양이 적은 실험실이나 일상적으로 소수의 분석만 실행하는 실험실의 경우 표준 96웰 형식의 저렴한 고정 블록 기기로 충분할 수 있습니다. 그러나 모듈식의 유연한 기기는 더 많은 수의 프로토콜, 다양한 샘플 용량, 자체 분석을 위해 동일한 기기에 의존하는 사용자가 더 많은 실험실 및 향후 처리 용량을 확장하고자 하는 실험실에 유리할 수 있습니다.